LA PCR EN TEMPS RÉEL ( pour spécialiste)

Etape 1 : Dénaturation

Pendant la dénaturation, réalisée à une température de 95°C, l’ADN double-brin est séparé en ses deux brins d’ADN constitutifs.

Etape 2 : Hybridation

Lors de l’étape d’hybridation, un oligonucléotide (la sonde) s’apparie à la séquence d’ADN qui lui est complémentaire. Deux molécules spécifiques, le rapporteur et le quencher bordent les extrémités de cet oligonucléotide. Le quencher piège la fluorescence du rapporteur tant que l’un et l’autre sont liés à la sonde non dégradée. Pendant l’hybridation, la sonde s’apparie à l’ADN de l’échantillon à une température de 70°C si l’échantillon contient la séquence cible recherchée.

Etape 3 : Polymérisation

Un deuxième oligonucléotide, l’amorce, s’hybride en amont, à quelques paires de bases de distance de la sonde. Une enzyme, l’ADN polymérase initie à 60°C la synthèse de l’ADN à partir de l’amorce en direction de la sonde.

Etape 4 : Emission de fluorescence

Durant cette dernière étape, l’enzyme dégrade la sonde et poursuit la synthèse du second brin d’ADN. Il en résulte que le rapporteur n’est plus localisé à proximité du quencher. La fluorescence émise par le rapporteur n’est alors plus piégée. Le signal fluorescent peut être quantifié.

Les étapes 1 à 4 sont répétées de 35 à 50 fois. À la fin de ce processus, la quantité d’ADN génétiquement modifiée est déterminée par la mesure de la fluorescence. Ce système est très sensible et permet souvent de détecter moins de dix copies d’ADN génétiquement modifiées.

Limite de détection – Limite de quantification

La limite de détection établie à partir de matériaux de référence certifiés est fiable à 0,01%, avec une excellente spécificité. (Une limite de détection plus faible exigerait l’utilisation de plusieurs micro-grammes d’ADN dans la prise d’essai, ce qui pourrait inhiber la PCR).

Néanmoins, la limite de détection et la limite de quantification ne dépendent pas seulement de la PCR. Elles dépendent aussi de l’échantillonnage, de la taille de l’échantillon et de son degré de transformation. Les produits alimentaires très transformés contiennent de l’ADN dégradé, ce qui peut réduire la probabilité de détecter des OGM.

En vue d’obtenir la plus basse limite de détection théorique, un échantillonnage adapté est nécessaire. La taille d’échantillon requise est variable selon la nature du produit, et en particulier, de la taille des particules et de leur homogénéité.

Par exemple : matières premières (grains de maïs, soja, colza) : 10 000 grains au minimum. Produits finis : environ 500 g ou 500 ml, si l’échantillon est homogène

Les nouveaux tests développés comportent des sondes plus courtes ce qui représente un grand avantage pour la détection d’ADN partiellement dégradé, comme par exemple dans les produits alimentaires transformés.

Un organisme génétiquement modifié (OGM) est un organisme vivant dont le patrimoine génétique, a été modifié par génie génétique (Directive CE 90/220).

Les tests d’OGM permettent de détecter la présence du promoteur, d’un terminateur ou d’un gène d’intérêt

Le pourcentage d’OGM, déterminé par la quantification, est défini par le ratio ADN OGM / ADN total de l’espèce cible.

résultats faux-positifs : Un résultat positif ne veut pas dire que l’on a affaire a un OGM. Une modification génétique peut arrivé d’un autre facteur extérieur sans incriminé le produit. Ce qui implique que le produit est un faux positif.